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TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用及机制研究

朱剑军  
【摘要】:临床前研究结果表明TNFα诱导肿瘤细胞凋亡呈剂量依赖性。然而,临床试验发现,在肿瘤治疗过程中,TNFα治疗诱发了显著的全身性毒性,并且患者对TNFα的最大耐受剂量较低,这严重阻碍了TNFα从基础研究向临床应用的转化。如何降低TNFα的毒副作用,如何在患者可忍受的剂量范围内提高TNFα的疗效,这急需我们去解决。我们的研究团队首次发现:在肝癌细胞中,TNFα能够诱导钙离子内流,并呈剂量依赖性。文献报道,细胞内钙离子(Ca~(2+))水平的变化与多种细胞活动密切相关。胞内钙离子的浓度能够决定细胞“生”与“死”。我们研究进一步发现TNFα诱导钙离子内流与细胞凋亡密切相关。基于此,我们提出本课题的科学假说:TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡;通过调控肝癌细胞钙离子摄入,放大TNFα介导的细胞凋亡;联合应用TNFα和钙离子摄取药物,能够有效提高抗肿瘤药物TNFα的肿瘤杀伤效果。【目的】本课题以肝细胞癌为研究对象,明确TNFα具有诱导钙离子内流的作用,探索TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡的作用及机制研究。【方法】1.利用Fura-2/AM活细胞染色,分析肝癌细胞胞浆钙离子水平的变化;2.利用Annexin-V凋亡检测、TUNEL等实验方法,检测细胞凋亡;3.利用免疫共沉淀实验,研究TNFα调控TRP通道蛋白的作用机制;4.利用裸鼠皮下荷瘤实验,检测TNFα在体内对肝癌生长及凋亡的影响;5.利用qPCR和免疫印迹等方法检测凋亡相关分子,分析TNFα介导的钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用机制;6.利用TMRM染色方法,检测肝癌细胞线粒体膜电位;7.利用免疫荧光,检测细胞色素c在肝癌细胞中的定位;【结果】第一部分:我们的研究结果显示:在肝癌细胞中,TNFα刺激导致胞浆钙离子水平显著升高,并呈剂量依赖性。通过干预细胞外液钙离子浓度,发现TNFα诱导后胞浆中升高的钙离子主要来源于细胞外液,与胞内钙库无关。第二部分:siRNA靶向沉默TNFR1后发现:TNFα诱导钙离子内流与TNFR1无关。电压型钙离子通道抑制剂Diltiazem和Verapamil对TNFα介导的钙离子内流没有影响,说明TNFα介导钙离子内流与电压型钙离子通道无关。TRP通道抑制剂CAI和SKF96365处理能够显著抑制TNFα介导的钙离子内流。siRNA靶向沉默TRPM7后TNFα诱导的钙离子内流显著降低。免疫共沉淀实验结果显示TNFα与TRPM7没有直接的相互作用,暗示TNFα以间接的方式激活TRPM7通道介导胞外钙离子内流。第三部分:通过检测细胞胞浆钙离子水平及细胞凋亡,发现降低胞浆钙离子水平能够显著抑制TNFα诱导的细胞凋亡;升高胞浆钙离子水平能够显著促进TNFα诱导的细胞凋亡。体内实验表明,过表达小清蛋白,清除胞浆钙离子,能够显著抑制TNFα的抗肿瘤活性;离子霉素联合TNFα治疗能够显著提高TNFα的肿瘤杀伤活性。第四部分:通过检测calpain活性及凋亡相关分子蛋白水平,证实:TNFα介导钙离子内流激活calpain/IAP/Caspase 3途径导致细胞凋亡。并且,通过检测线粒膜电位,细胞色素c定位和Bcl-2家族相关分子,证实:TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡与线粒体介导的内源性凋亡途径无关。【结论】本课题研究发现:在肝癌细胞中,TNFα通过介导胞外钙离子内流激活calpain/IAP/Caspase 3途径促进细胞凋亡,暗示改变胞浆钙离子水平可能是一种提高TNFα肿瘤杀伤活性的有效策略。


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